基于微流控芯片平台的分子生物学检验新技术诞生于21世纪初,我国在这个领域的发展处于世界前列。微流控芯片具有便携性强、操控智能和分析通量高的优势,因此在该领域发展迅速,近年来已经有很多芯片分子生物学检测产品走上市场进入实际应用。以下介绍两种重要的微流控芯片分子生物学检测技术。
(1) PCR芯片: PCR是一项传统的常规分析技术,最早于1986年由Mullis提出,是现代分子生物学研究必不可少的体外核酸扩增技术,具有操作简单、成本较低和特异性强的特点。 PCR技术含有三个反应步骤,分别是高温解链、低温退火和中温延伸。在反应体系中需要加入具有耐高温特性的DNA聚合酶,这种酶在引物和模板链的共同作用下,能够在短时间内生成数十乃至数百万倍的模板DNA扩增。在常规技术条件下,这种PCR热循环反应(三个不同温度依次循环)需要在专门为此设计的核酸扩增仪内进行,热循环次数在25~ 35个循环,整个反应耗时2 ~3 h。而对于较短的小片段核酸的扩增,可以采用两步法PCR,将低温退火和中温延伸合二为一,进一步简化反应步骤,减少反应时间,相比于摇瓶增菌法等分析方法,PCR可以大幅缩短检测耗时。此外, PCR技术的检测灵敏度较高,与ELISA方法相似,最低检测极限(LOD)通常最低为数十个病原菌(对于普通拷贝数的核酸片段而言),而实时定量PCR则可以进一步降低检测极限。 PCR技术也可以与常规的DNA微阵列方法相结合,通过引入巧妙设计的探针片段,仅进行一次16S rRNA扩增就可以对多个靶标片段做高通量分析。常规的PCR技术也存在很多缺陷,例如,反应需要在聚丙烯微管中进行,由于管内的反应液受热不均匀以及热传导效率低下的缘故,反应体系在进行热循环时,升温和降温的速率较慢,所需的温度平衡时间较长。而受到人工操作的误差及溶液蒸发等因素影响,在配置反应体系的过程中难免产生较大误差。此外, PCR扩增的反应体系通常为20~ 100μl,消耗的样本量较大,而且Taq耐热核酸聚合酶及其他反应所需的试剂价格较贵,反应成本较高。PCR反应的产物在进行后续步骤的反应之前,需要先经过处理,例如DNA提纯等,需要将产物取出并重新配置反应体系,而无法将一系列的反应过程集成进行。这些是常规PCR技术存在的一些问题,在该技术数十年的发展历程中,始终没有得到解决,根源即是所依赖的宏观条件下的操作手法很难再有实质性的突破。然而,基于微流控芯片的微型化PCR扩增平台,则可以在很大程度上解决上述问题,并进一步扩大其固有优势。